Dulbecco sinh tại Catanzaro (miền nam Ý), mẹ là người vùng Calabria còn cha là người vùng Liguria. Ông tốt nghiệp trung học năm 16 tuổi, sau đó vào học ở Đại học Turin. Mặc dù rất quan tâm tới toán học và vật lý, nhưng ông lại quyết định học y học. Khi mới 22 tuổi, ông tốt nghiệp ngành giải phẫu bệnh học và bệnh lý học dưới sự kèm cặp của giáo sư Giuseppe Levi. Trong những năm này, ông đã gặp Salvador Luria và Rita Levi-Montalcini, những người bạn đã khuyến khích ông sang Hoa Kỳ sau này. Năm 1936 ông được gọi nhập ngũ với chức vụ sĩ quan quân y, đến năm 1938 thì giải ngũ. Năm 1940 Ý tham gia thế chiến thứ hai, Dulbecco lại bị gọi tái ngũ và gửi tới mặt trận ở Pháp và Nga, nơi ông bị thương. Sau thời gian nhập viện và sự sụp đổ của chế độ phát xít, ông theo phe kháng chiến chống lại quân Đức chiếm đóng.